Real-time RT-PCR high-resolution melting curve analysis to detect and differentiate Brazilian variants of grapevine viruses

Detecting and identifying viral infections in perennial plants, such as grapevines, can be challenging. Therefore, the aim of this study was to perform a real-time RT-PCR (RT-qPCR) high-resolution melting (HRM) curve analysis to detect and differentiate Brazilian variants of grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) and grapevine fanleaf virus (GFLV) in 74 and 10 infected plants, respectively, maintained in a collection block of grapevines. A single amplification curve was generated for each sample by RT-qPCR. Considering the amplified region of genomes of these two viruses, it was possible to identify and distinguish different variants of GLRaV-3 and of GFLV, which showed significantly different melting temperature (Tm) values between themselves, reflecting differences in the nucleotide sequences of the respective amplicons, and allowing discriminating variants and assess the viral diversity in grapevine accessions. The HRM analysis was validated by sequencing and nucleotide comparisons among Brazilian isolates of GLRaV-3 and GFLV. Detectar e identificar infeccoes virais em plantas perenes, como videiras, pode ser um desafio. Portanto, o objetivo deste estudo foi realizar uma analise da curva de dissociacao de alta resolucao (HRM) por RT-PCR em tempo real (RT-qPCR) para detectar e diferenciar variantes do virus do enrolamento foliar tipo 3 (GLRaV-3) e do virus do urticado ou no-curto (GFLV) em 74 e 10 plantas infetadas, respectivamente, mantidas em blocos de colecoes de videiras. Uma unica curva de amplificacao foi gerada para cada amostra por RT-qPCR. Considerando a regiao amplificada dos genomas dos dois virus, foi possivel identificar diferentes variantes de GLRaV-3 e GFLV, que apresentaram valores de temperatura de dissociacao (Tm) significamente diferentes entre si, refletindo diferencas nas sequencias de nucleotideos dos respectivos DNA amplificados e, assim, constituindo uma forma simplificada de diferenciar variantes e avaliar a diversidade viral em acessos de videiras. A analise de HRM foi validada pelo sequenciamento e comparacao de nucleotideos de isolados brasileiros de GLRaV-3 e GFLV.