不同剂量TGF-β1在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用

目的分析联合应用不同剂量TGF-β1对BMP9诱导间充质干细胞成骨分化过程的影响,寻找最佳的促进BMP9成骨的TGF-β1剂量,为联合不同细胞因子促进组织工程骨再生寻找有效途径。方法应用鼠间充质干细胞株C3H10T1/2,以重组腺病毒法将其导入BMP9,再分别施加0、5、10、20 ng/mL TGF-β1蛋白处理,建立BMP9联合TGF-β1诱导间充质干细胞成骨分化模型。条件培养基法获取含活性良好的TGF-β1蛋白上清液;改良SEAP化学发光法和组织化学染色法检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)表达及活性;茜素红S染色检测钙盐沉积;实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测成骨相关基因Ⅰ型胶原(collagenⅠ,COLⅠ)、骨桥素(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)的mRNA转录表达水平和蛋白表达水平改变;流式细胞仪检测细胞周期;台盼蓝拒染法计数活细胞监测细胞增殖。结果 5 ng/mL TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理能更早、更多地提高ALP活性和引起钙盐沉积,持续处理17 d后钙盐沉积结果不再显示明显差异,TGF-β1单独处理与对照组间无明显差异。随TGF-β1剂量增加,ALP活性和钙盐沉积效应受到抑制。5 ng/mL TGF-β1与BMP9联合处理较BMP9单独处理使COLⅠ、OPN、OCN的mRNA转录水平和蛋白表达水平明显增高,COLⅠ增高变化发生较早和显著;TGF-β1应用剂量达到20 ng/mL出现基因转录和蛋白表达受到抑制,但COLⅠ升高趋势仍能维持。BMP9促进细胞增殖,TGF-β1对该效应起抑制作用,细胞周期转化表现G0/G1期阻滞。结论在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中,适量的TGF-β1联合应用具有促进作用;BMP9与TGF-β1在诱导成骨分化中可能存在协同作用关系。